V lidském mozku se nachází zhruba sto miliard nervových buněk, z nichž každá vytváří tisíce propojení. Jak ale každý jednotlivý neuron ví, s kým se propojit a kam přesně růst? To je jedna ze základních otázek neurobiologie. Rozlousknout se ji snaží Daniel Rozbeský z Přírodovědecké fakulty UK a centra BIOCEV. Pomůže mu v tom nyní i získání prestižního grantu ERC CZ ve výši 18,2 milionu korun.
Co je to axonální navigace?
Hlavní experimentální téma naší laboratoře. Zabýváme se tím, jak se axony a neurony pohybují relativně komplexním prostředím během vzniku nervové soustavy. V lidském mozku máme zhruba sto miliard nervových buněk. Každá z nich vytváří asi tisíc různých kontaktů a propojení s jinými nervovými buňkami. To znamená, že v hlavě máme zhruba sto bilionů různých spojení, které definují naši osobnost. Určují naši paměť, pohyb, řeč i to, jak reagujeme na vnější podněty, zkrátka definují celého člověka.
Fundamentální otázkou v neurobiologii je, jak tato obrovská a komplikovaná síť vůbec vzniká. Můžeme si to představit tak, jako kdybychom měli sto bilionů kabelů a museli je úplně přesně zapojit do sta bilionů zásuvek. Nervová buňka má výběžek, takzvaný axon. Ten se během vývoje nervové soustavy pohybuje a potřebuje se dostat z bodu A do bodu B. Jak to ale v tak komplexním prostředí dělá, když nemá žádnou mapu?
Nevím. Jak?
Potřebuje navigaci. Existují signální molekuly, takové molekulární GPS, které se na axony vážou. Na axonech jsou různé receptory, molekuly se na ně navážou, a tím se informace z vnějšího prostředí dostává dovnitř buňky. Přesně tímto tématem jsem se zabýval už během svého postdoku v Oxfordu. Zkoumal jsem, jak tyto molekuly vypadají na atomární úrovni, jak se vážou na receptory a jak se celá signalizace moduluje.
Nyní se zabýváme tím, co se děje uvnitř buňky. Axon se musí v určitých bodech rozhodnout, jestli zabočí vlevo, vpravo, nebo pojede rovně. Nebo když roste axon v levé hemisféře, musí se rozhodnout, zda v ní zůstane, nebo bude pokračovat do pravé. Ta základní otázka je, jak to pozná. Klíčovou vnitřní strukturou, která o tom rozhoduje, je cytoskelet – vnitřní kostra buňky. Na rozdíl od lidské kostry, která je pevná a rigidní, je ale ta buněčná extrémně dynamická. Neustále vzniká a zaniká.
Jak přesně takové buněčné rozhodování vypadá?
Na konci axonu je útvar, kterému se říká růstový kužel. Funguje jako senzor. Představte si to, jako když jdete potmě a rukama ohmatáváte prostor kolem sebe. Axon podobně ohmatává růstovým kuželem své prostředí. Když dostane signál, že má putovat konkrétním směrem, stimuluje se v dané části tvorba cytoskeletu, takzvaných aktinových filamentů (vláken). Vzniká jich velké množství, buněčná membrána se začne prodlužovat a buňka roste daným směrem.
Naopak, když dostane signál „stop“, což si můžete představit, jako když potmě narazíte třeba do lednice, aktinová vlákna se začnou rozpadat a fragmentovat na malinké kusy. Buněčná membrána v tom směru zkolabuje a pohyb se utlumí. Nás v laboratoři zajímá jeden konkrétní protein, enzym jménem MICAL1, o kterém si myslíme, že toto celé ovlivňuje. Když se aktivuje, začne aktinové filamenty rozsekávat a buňka díky němu dokáže zastavit svůj růst v konkrétním směru.
Takže vás dnes zajímá hlavně tento protein?
Ano, a to na několika úrovních. Tento enzym volně plave uvnitř buňky a musí být nějakým způsobem inaktivován – jeho aktivita musí být vypnuta, jinak by zničil všechny aktinové filamenty v okolí. Před dvěma lety jsme v časopise Nature Communications publikovali jeho strukturu, díky tomu jsme totiž zjistili, jak se tento protein vypíná. Další dva roky jsme pracovali na tom, abychom zjistili, jak se naopak zapíná. Právě o tom dokončujeme rukopis. Podařilo se nám totiž až na atomární úrovni zmapovat, jak k jeho aktivaci dochází.
Dále nás zajímá, jak se váže na aktinová vlákna a jak je rozsekává. Z literatury víme, že má unikátní vlastnost, tedy že chemicky vlákna modifikuje tím, že je oxiduje. Doslova je posype atomy kyslíku, kvůli čemuž se vlákno začne rozpadat. To se budeme snažit detailně pochopit.
Teď jste získal grant ERC CZ. Využijete ho právě k tomu, abyste toto téma mohl se svým týmem dále rozvíjet?
Chtěli bychom pochopit na molekulární úrovni, jak dochází k depolymerizaci neboli rozštěpení aktinu. Díky projektu ERC CZ se budeme moci posunout na buněčnou úroveň. Budeme pracovat přímo s neurony. Nejprve se na ně podíváme klasickým fluorescenčním mikroskopem a budeme k nim přidávat různé naváděcí molekuly, které jim říkají „stop“ nebo „go“. Jelikož si umíme aktinová vlákna rozsvítit, uvidíme, v jaké části buňky dochází k jejich rozpadu, jaká je dynamika tohoto procesu a jak dlouho trvá. To je první část projektu.
A ta druhá?
První část je o fluorescenční mikroskopii, která nám poskytne informace o dynamice. Její nevýhodou je ale rozlišení, nedostaneme se úplně do detailu. K tomu využijeme takzvanou kryoelektronovou tomografii. Jsem přesvědčen, že se ve strukturní biologii stane metodou 21. století. Doposud, když jsme chtěli určit strukturu proteinů, museli jsme je nejprve vyrobit a purifikovat nebo izolovat z jejich přirozeného buněčného prostředí. Při rentgenové krystalografii bylo navíc nutné protein převést do podoby krystalu, zatímco u nukleární magnetické rezonance se studoval rozpuštěný v roztoku a u kryoelektronové mikroskopie se jednotlivé proteinové částice rychle zmrazily v tenké vrstvě roztoku. Výhoda tomografie spočívá v tom, že se budeme dívat na strukturu přímo uvnitř buněk nebo na jejich povrchu přímo v buněčném kontextu. Uvidíme, s jakými jinými strukturami proteiny interagují nebo na jaké části membrány se nacházejí.
Je to relativně komplikovaná metoda, která je ještě v plenkách. Věřím ale, že za několik desítek let dosáhneme velmi vysokého rozlišení a uvidíme konkrétní architekturu proteinů až na úrovni atomů. Poskytne nám to odpovědi na otázky, které jsou staré desítky, stovky, možná i tisíc let. Bude hrozně zajímavé u toho být.
Na jakém principu kryoelektronová tomografie funguje?
Živou buňku, v našem případě neuron, bleskově zmrazíme. Ponoříme ho do kapalného etanu a pak do kapalného dusíku, čímž okamžitě zastavíme všechny procesy uvnitř. Poté buňku vložíme do kryoelektronového mikroskopu a budeme ji postupně natáčet a třeba každé čtyři stupně sejmeme data. Z těchto úhlových projekcí pak spočítáme 3D strukturu axonu s velmi vysokým, možná až nanometrovým rozlišením.
Nevýhodou této metody oproti fluorescenční je, že zamrazením ztratíme časovou škálu procesu. Zastavíme čas. Proto musíme obě metody kombinovat. Spojíme atomární úroveň s pohybem celé buňky a zároveň propojíme různé časové škály. Představit si to můžete tak, jako byste chtěla pochopit pohyb letadla v oblacích – jestli letí nahoru, dolů, doleva nebo doprava – a zároveň se během letu dívala přímo do jeho motoru, jak přesně funguje.
Ve třetí oblasti projektu se pokusíme získané informace využít k tomu, abychom axony cíleně směrovali. Využijeme k tomu mikrofluidiku. Vytvoříme labyrint malých komůrek, do kterých budeme přidávat signální molekuly, a pokusíme se axon navigovat z bodu A do bodu B.
Když se píšou velké ERC granty, jedním z požadavků je postavit projekt, který jde za hranice dosavadního poznání, s čímž se logicky pojí značná rizika. Co myslíte, že by u vašeho projektu mohlo dělat potíže?
Vidím dvě velká rizika. První je experimentální, tedy jestli se nám skutečně podaří propojit onen časový a prostorový svět.
Druhé riziko je konceptuální. Může se ukázat, že je naše hypotéza špatná a protein MICAL1 nehraje v navigaci axonu tak klíčovou roli, jak si myslíme. Možná je zásadní pro úplně jiné procesy, nebo je v navigaci klíčový nějaký úplně jiný protein, o kterém zatím nevíme. Ale to je na celém projektu právě to nejzajímavější.
I nepotvrzení hypotézy přináší nové poznání.
Přesně tak. Některé národní granty se koncipují tak, že do přihlášky musíte napsat, co přesně chcete studovat, jak to budete dělat, co z toho vzejde a jaké to bude mít využití. To je přece strašná nuda, když si hned na začátku nalajnujete celý projekt až do konce. Grant ERC je zajímavý právě tím, že nevíte, jak dopadne. Máme silnou hypotézu, ale všechno může být jinak.
Pohybujete se na úrovni základního výzkumu, ale kdybychom se podívali na možnou budoucí aplikovatelnost, jaká by byla v případě vašeho projektu?
Osobně mě zajímá hlavně fundamentální základní výzkum. Procesy, které jsem zmiňoval, jsou zodpovědné za celou řadu patologií. Jde o různé poruchy nervového vývoje, například autismus. Existují také studie, které poukazují na propojení axonální navigace s Alzheimerovou chorobou, protein MICAL1 se dává do souvislosti s epilepsií či nádorovými onemocněními. V našem projektu necílíme primárně na vývoj léčby, ale chceme pochopit fundamentální mechanismy. Až ve chvíli, kdy tyto procesy do hloubky pochopíme, je někdo další může aplikovat na vývoj cílené léčby.
Když jste pracoval na žádosti o ERC grant, co nejvíce vám osobně pomohlo? A co byste zpětně udělal třeba jinak?
Univerzita Karlova má velmi dobrý tréninkový program pro uchazeče o ERC granty, který organizuje především pan profesor Zdeněk Strakoš z Matfyzu. Už před několika lety jsem zkoušel žádat o ERC Starting grant a tehdy jsem absolvoval celý přípravný cyklus. Hrozně se mi to líbilo. Profesor Strakoš má obrovský dar jednoduše vysvětlit, jak žádost napsat, a také upozornit, kolik času tomu člověk musí věnovat. Univerzitní servis i fakultní program pro uchazeče je na skvělé úrovni.
Zásadní pro mě byla i zpětná vazba od kolegů. Projekt jsem posílal jak expertům na strukturní biologii, tak lidem úplně mimo můj obor. Na základě toho jsem se snažil svou žádost stále vylepšovat.
Na druhou stranu platí, že zpětná vazba někdy i škodí. Když pošlete vypilovaný projekt spoustě lidí, vždy se najde někdo, komu se něco nezdá, a rady jdou pak často i proti sobě. Člověk to musí v určitém bodě umět stopnout, zamyslet se nad tím a finálně si vše vyhodnotit sám. Čerpal jsem samozřejmě i ze zkušeností z Oxfordu, kde jsem byl v kontaktu s mnoha lidmi, kteří už byli u ERC úspěšní a svoje žádosti mi poskytli jako vzor.
Postdoktorandský pobyt na Oxfordu musela být jistě silná a formující zkušenost…
Byla to velmi tvrdá škola. Měl jsem tam mentora a supervizora, který byl byrokraticky extrémně vytížený, což vyžadovalo obrovskou samostatnost. Každý člen týmu si musel navrhnout experimenty, vyhodnotit výsledky, napsat článek, zformulovat dopis editorovi a práci odeslat. Narazil jsem přitom na extrémní množství problémů, které mě formovaly a naučily klást si ty „velké otázky“. A to je pro získání ERC grantu zásadní – umět si položit tu základní, fundamentální „big question“ a zkusit na ni najít odpověď.
V jednom starším rozhovoru jste zmínil, že vás nejvíc baví dělat „vědu rukama“. Dostanete se jako vedoucí týmu vůbec ještě k té ryzí laboratorní práci?
Bohužel už jen velice omezeně, což je obrovská škoda, protože mě to neskutečně baví. Chybí mi vzrušení z objevování. Pamatuji si, jak jsem v Oxfordu asi tři roky pracoval na jednom projektu. Bylo potřeba vyrobit protein, vyčistit ho a vykrystalizovat. Neustále se objevovaly nějaké problémy, ale nakonec jsme krystaly získali. Naším cílem pak bylo určit strukturu takového komplexu. Finálním krokem bylo sebrání dat z krystalů na obřím synchrotronu (urychlovači částic). Pamatuji si, jak jsem asi ve tři ráno seděl u počítače na univerzitě a čekal, až nám dorazí výsledný datasat z urychlovače. Ještě dnes cítím to napětí. Když dorazil, byl jsem tak zvědavý, že jsem se rozhodl to uprostřed noci všechno ještě rychle spočítat. Dělal jsem to asi na dvaceti počítačích a během hodiny jsem dostal první výsledky. Viděl jsem na nich, že se to povedlo. Tak jsem sedl na kolo a spokojený jel domů. Bylo asi šest hodin ráno, náš kampus byl na takovém kopečku, zrovna vycházelo slunce a opíralo se do těch oxfordských věžiček, které tam stojí stovky let. Cítil jsem obrovskou satisfakci. Tohle napětí a radost z poznání mi dnes trochu chybí.
V roce 2021 jste se z Oxfordu přesunul do Česka, kde jste si v centru BIOCEV začal stavět vlastní laboratoř. Jakých pro vás bylo uplynulých pět let?
Hodně náročných. Nejdřív nastal boj o prostor, pak jsem si musel postavit celý tým. Měl jsem naštěstí slušné granty – univerzitní Primus, Junior Star GA ČR. Naše práce je ale experimentálně náročná, takže jsem musel kupovat různé přístroje od chromatografických systémů, velkých centrifug a dalších přístrojů. A to znamenalo ponořit se do pekla výběrových řízení. Chápu, že jsme financováni z veřejných peněz a transparentnost je nutná, ale systém nás neustále tlačí do nákupu toho nejlevnějšího zařízení. S tím se ale špičková věda dělat nedá.
České vědě by hodně pomohlo uvolnění rozpočtových pravidel. Granty máme sešněrované do kolonek na personální výdaje, materiál, cestovné... Přesouvat peníze mezi nimi je hrozný problém. Chtěl bych proto vyzdvihnout program Primus, který byl krásně otevřený, flexibilní a přitom naprosto transparentní. Kdyby takhle fungovaly všechny národní granty, bylo by to skvělé.
Limituje nás také délka financování. Obvykle jsou koncipovány na tři roky, jenže v mojí oblasti na žádnou „big question“ za tři roky neodpovíte. Kdyby byly na pět let, extrémně by nám to pomohlo.
První roky zpět v Česku byly proto náročné, až po třech letech jsme konečně začali produkovat reálné výsledky, tým si sedl a teprve teď začínáme sklízet skutečné plody naší práce.
Pocházíte z Trnavy. Neuvažoval jste o tom, postavit si výzkumnou skupinu na Slovensku?
V Oxfordu jsme s manželkou řešili dilema, zda zůstat tam nebo zvolit Česko či Slovensko, odkud oba pocházíme. Po brexitu se ale situace v Británii dramaticky změnila. Obrovské množství lidí odešlo do kontinentální Evropy, do toho přišel covid. Když se dnes bavím s lidmi z Oxfordu, slyším, jak se z něj ta uvolněná a tvůrčí mezinárodní atmosféra kvůli všem těmto okolnostem trochu vytratila.
Zvažovali jsem i Slovensko, ale politická i finanční situace ve vědě je tam celkově velmi špatná. Za posledních dvacet let tam nastal obrovský exodus inteligence a prostředky, které tam do vědy plynou, se s Českem nedají vůbec srovnávat. Navíc si myslím, že se stav na Slovensku bohužel v nejbližších desetiletích jen tak nezlepší.
Abychom nekončili tak depresivně, jakého dosavadního vědeckého úspěchu si nejvíc ceníte?
Baví mě sledovat cesty mých nadaných studentů. Měl jsem třeba velmi talentovaného magisterského studenta, který u nás „přičichl“ k různým metodám a způsobům vědeckého myšlení. Dnes je rozvíjí ve špičkovém Max Delbrück Center v Berlíně, kde se mu velmi daří. Stejně tak u mě pracoval jeden schopný postdok, který dnes působí ve výzkumném institutu v Okinawě. Zjišťovat, jak fungují molekulární mechanismy, je skvělé a neskutečně mě to baví, ale to, že mohu někomu předat znalosti a následně sledovat, jak jeho potenciál roste, je pro mě ten úplně největší úspěch.
| Mgr. Daniel Rozbeský, Ph.D. |
| Absolvoval biochemii na Přírodovědecké fakultě UK, kde také obhájil dizertaci. Sedm let působil jako postdoktorand v týmu Yvonne Jones na Univerzitě v Oxfordu. V roce 2021 se vrátil do České republiky, kde si při centru BIOCEV založil vlastní laboratoř zaměřenou na strukturní neurobiologii (tzv. Rozbesky Lab). Působí také na Katedře buněčné biologie Přírodovědecké fakulty UK a Ústavu molekulární genetiky, AV ČR. Zabývá se strukturní biologií signálních molekul a receptorů na povrchu buněk, které hrají klíčovou roli v neurobiologii a lidských onemocněních. V minulosti získal grant UK Primus i Junior Star Grantové agentury ČR. Letos usiloval o získání ERC Consolidator grantu. Ačkoliv hodnotící panel Evropské výzkumné rady jeho projekt vyzdvihl, z důvodu omezeného rozpočtu nedosáhl na financování z evropských prostředků. Následně ho ale podpořilo Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR a Daniel Rozbeský na svůj výzkum získal národní grant ERC CZ ve výši 18,2 milionů korun na dobu dvou let. |
