Stačilo by odstranit jen několik procent neuronů a epileptické záchvaty by mohly zmizet. Tým neurovědce Ondřeje Nováka z 2. LF UK hledá způsob, jak tyto patologické buňky cíleně zasáhnout a zdravé zachovat. „Taková léčba by byla svým způsobem chirurgicky přesná, neuron po neuronu, ale bez skalpelu,“ popisuje možnou budoucí léčbu vědec, který pomocí unikátního mikroskopu sleduje fungování živého mozku na úrovni jednotlivých buněk.
Letos na jaře jste získali nový kombinovaný třífotonový mikroskop s rychlou dvoufotonovou nástavbou. V čem posouvá možnosti vašeho výzkumu?
Ta technologie je zcela unikátní, dokonce i ve světovém měřítku. Podobných mikroskopů může být na světě kolem deseti a skupiny, které s nimi publikují, byste spočítala na prstech jedné ruky. Mikroskop pomocí laseru skenuje tkáň a vytváří obraz za obrazem. Díky nelineárním optickým principům dokáže pořizovat třeba třicet snímků za sekundu, a to až do hloubky kolem 1,5 milimetru. To se nemusí zdát jako mnoho, ale u myši je to tloušťka mozkové kůry a můžeme se dostat dokonce i do hipokampu.
Při takové rychlosti už nemusíme sledovat jen strukturu mozku – kudy vedou jednotlivé neurony nebo kde je tkáň poškozená. Můžeme pozorovat také jejich funkci. Necháme v neuronech vytvořit protein, který podle jejich aktivity více či méně svítí. Doslova pak před sebou vidíte třeba třicet neuronů rozmístěných jako kuličky a sledujete, jak jednotlivě blikají podle toho, jak jsou aktivní. Myška přitom sedí pod mikroskopem, dívá se před sebe a my v reálném čase pozorujeme, jak její mozek funguje na úrovni jednotlivých buněk.
Proč je pro tento výzkum stále nezbytný živý zvířecí model a co všechno musí podobné experimenty splňovat z hlediska etiky?
To je dobrá otázka. Jsem původně fyzik a když jsem začínal pracovat se zvířaty, bylo pro mě velmi nepříjemné každou myš nebo potkana po experimentu usmrtit. Vlastně jsem za ně skoro dělal zádušní mše.
Když se mě dnes moje malé děti ptají, co s myškami děláme, vysvětluji jim, že máme myši, které jsou podobně nemocné jako děti v nemocnicích. A u těchto myší vymýšlím léčbu, která bude pak stejně fungovat na ty nešťastné děti. Konkrétně se díky nim snažíme zjistit, jak nemoc ovlivnit kauzálně, tedy jak vyvinout léčbu, která nebude pouze potlačovat symptomy-záchvaty, ale bude skutečně léčit samotné onemocnění. Pokud se nám to podaří u myší, můžeme další kroky zkoušet na skutečné lidské tkáni. Jde například o tkáň odebranou dítěti při resekci, která je indikována kvůli jeho léčbě, nikoli kvůli našemu výzkumu. Pokud stejný princip funguje i tam, výrazně se přibližujeme možnosti, že se jednou naše řešení dostane do klinické praxe.
Pro sebe si to srovnávám tak, že dodržujeme všechny zákonné postupy, které jsou u nás velmi přísné, a je to tak dobře. Zvíře nesmí zbytečně trpět a v rámci možností musí mít maximální komfort. Samotná epilepsie samozřejmě představuje diskomfort, jinak se ale snažíme zvířatům zajistit co nejlepší podmínky. Nechci tím zastírat, že je používáme pro výzkum. Pro mě je důležité, aby byl takový výzkum obhajitelný a abych si vůči zvířatům zachoval dostatečnou citlivost.
Dokážete sledovat jeden konkrétní neuron opakovaně třeba několik týdnů. Jakým způsobem se do živého mozku díváte? Říkal jste, že myš je přitom bdělá.
Používáme technologii takzvaného kraniálního okna. Myši na hlavu připevníme titanový konstrukt s kruhovým otvorem, v něm odstraníme malou část lebky a nahradíme ji krycím sklíčkem. Tím získáme v podstatě permanentní optický přístup do mozku.
Myš potom normálně žije a například po týdnu ji můžeme znovu umístit pod mikroskop. Podle větších a menších cév si najdeme přesně stejné místo a stejné neurony jako při předchozím měření. K jednotlivým buňkám se tak můžeme vracet. To je důležité třeba při testování léčby. Patologické neurony máme označené červeně a zdravé zeleně. Nejprve je zobrazíme, potom aplikujeme léčbu a po určité době se ke stejným buňkám vrátíme. Pokud červené zmizí a zelené zůstanou, můžeme přesně vyhodnotit, nakolik se nám podařilo selektivně odstranit patologické buňky.
Při samotném zobrazování je myš bdělá a vše je už zahojené. Zhruba hodinu je fixovaná za hlavu pod mikroskopem a tělo má v úzké průhledné trubici, ve které se zklidní. Díky tomu můžeme sledovat mozek bez anestetik, která by jeho fungování výrazně ovlivnila. Titanový držák navíc udržuje hlavu natolik stabilní, že se nám sledovaný neuron nepohne ani o mikrometr.
Zaměřujete se na epilepsii spojenou s vývojovou malformací mozkové kůry. Co se při tomto onemocnění v mozku děje?
Když se mozek vyvíjí, neurony vznikají z buněk zvaných radiální glie a postupně vytvářejí jednotlivé vrstvy mozkové kůry. V určité chvíli ale může v jedné z těchto buněk vzniknout mutace, typicky jde jen o bodovou změnu v genomu. Není tedy přítomná v celém těle, ale pouze v této buňce a následně v buňkách, které z ní vzniknou. Výsledkem je určitý okrsek špatně uspořádané mozkové tkáně, který si můžete představit jako malý lívanec nebo minci. Zajímavé je, že i v této lézi nese mutaci třeba jen pět procent buněk, zatímco ostatní jsou zdravé.
A právě to vyvolává zásadní otázku: Jak může pět procent patologických neuronů strhnout do epileptického záchvatu zbývajících 95 procent neuronů v lézi, a nakonec ovlivnit celý mozek?
Je to o to závažnější, že výsledkem bývá farmakorezistentní epilepsie, která velmi špatně odpovídá na léčbu. Ani kombinace několika léků nemusí záchvaty zastavit, pouze sníží jejich počet. Navíc jde často o epilepsii s velmi časným nástupem, už během prvních měsíců nebo let života. Pokud dítě od začátku přechází z jednoho záchvatu do druhého, může to výrazně zpomalovat jeho psychomotorický vývoj. Během záchvatu se nemůže učit, mozek je vyčerpaný a mezi záchvaty se zase musí regenerovat a vracet do normálního stavu. Přitom těch záchvatů mohou mít tyto děti i desítky denně.
Dokážete určit, které konkrétní neurony se na vzniku záchvatu podílejí?
Víme, že právě buňky nesoucí mutaci jsou pro vznik záchvatů zásadní. Ukázaly to experimenty na myších. Dokážeme vytvořit model, ve kterém během vývoje mozku vznikne stejný typ mutace. Myš se narodí a kolem osmého až desátého týdne začne mít výrazné epileptické záchvaty. Když ale následně mutaci v patologických neuronech molekulárně „vypneme“, tyto neurony se zmenší a záchvaty postupně vymizí.
To je nesmírně důležité zjištění. Mozková kůra sice zůstává vývojově špatně uspořádaná, ale když odstraníme samotnou příčinu, tedy působení mutace, vede to k vymizení záchvatů. To je obrovská motivace pokusit se patologické neurony buď nějakým způsobem vypnout, nebo je selektivně odstranit. Pokud bychom dokázali odstranit pouze těch zhruba pět procent neuronů, těch nesoucích mutaci, mohla by to být skutečně kauzální léčba, která neztlumí jen záchvaty, ale zasáhne jejich příčinu.
U experimentálních myší to dokážeme pomocí genetického inženýrství. Společně s mutací vložíme do patologických buněk jakýsi „kill switch“. Když pak podáme určitou látku, zahubí pouze buňky, které tento mechanismus obsahují. U dítěte samozřejmě nic takového v patologických neuronech není. Proto hledáme jejich přirozenou Achillovu patu – vlastnost, kterou patologické neurony mají a zdravé ne a na kterou bychom mohli léčbu cíleně zaměřit.
Jak se tato epilepsie léčí dnes?
Pokud je dysplastická léze viditelná na magnetické rezonanci, zkušený radiolog ji dokáže najít – mozková kůra je v tom místě špatně uspořádaná a na snímku může být patrná určitá abnormalita. Pokud se zároveň nenachází v takzvané elokventní oblasti, která je zásadní například pro řeč nebo jinou důležitou funkci, je možné ji chirurgicky odstranit. Zajímavé je, že zejména u malých dětí dokáže mozek případnou funkci této oblasti převzít a rozdělit jinam. Dítě pak může žít normální život, mít normální intelekt a v ideálním případě být úplně bez záchvatů i bez léků.
Pokud už dnes dokáží lékaři dětem chirurgicky pomoci, jak do toho zapadá váš výzkum?
Problém je, že jde o chirurgii mozku a dále také, že chirurgické odstranění léze není možné u všech těchto dětí. Často ji nelze přesně lokalizovat, je příliš rozsáhlá či rozptýlená, nebo se nachází v oblasti mozku, kterou si nelze odstranit – například v centrech důležitých pro řeč.
A právě pro tyto děti hledáme jinou možnost. Pokud by se nám podařilo naši léčbu dotáhnout do klinické praxe, nemusel by se odstraňovat celý kus mozkové kůry. Byla by svým způsobem chirurgicky přesná, neuron po neuronu, ale bez skalpelu – pomocí chytrého cílení pouze na patologické buňky. Teoreticky bychom tak mohli zasáhnout i neurony v oblastech důležitých například pro řeč.
A co se týká časového výhledu – jak daleko jste od toho, aby se podobná léčba mohla dostat k pacientům?
To je na vědě krásné a zároveň i strašně frustrující. Řekneme si: najdeme Achillovu patu patologických buněk a zničíme je. Jenže ji najdeme, zkusíme na ni zacílit a ono to třeba napoprvé nefunguje. Zvýšíme dávku a začne to fungovat částečně. Všechny tyhle kroky jsou velmi postupné a těžko se u nich odhaduje časový horizont.
Navíc se ukazuje, že situace je složitější, než jsme původně předpokládali. Mutace může vzniknout v několika různých genech, a přitom vést k podobnému výsledku. Původní představa jednoho univerzálního léku se proto začíná posouvat směrem k personalizované léčbě, která bude vycházet z toho, co se děje v buňkách konkrétního pacienta.
Jak tedy chcete patologické buňky v lidském mozku cíleně odstranit, když na rozdíl od experimentálních myší nemají žádný uměle vložený „vypínač“?
Využíváme fenomén, kterému se říká buněčná senescence, zjednodušeně buněčné stárnutí. Při poškození si může buňka sama zapnout vnitřní signál, že už nemá dál fungovat, a spustit programovanou buněčnou smrt, apoptózu. Dlouho se přitom předpokládalo, že neuronů se senescence netýká, protože se nedělí.
Ukázalo se však, že i neuron se může během života určitým způsobem „opotřebovat“, nastřádat poškození. U patologických neuronů, které studujeme, vede mutace mimo jiné k problémům s vnitřním prostředím buňky a odstraňováním buněčného odpadu. Postupně se poškozuje DNA, se zvětšují, poškozují okolní buňky svými působky, které vypouštějí, a objevují se u nich známky senescence. Buňka tak zapíná signál, že je poškozená a měla by spustit apoptózu.
Jenže právě mutace způsobující onemocnění zároveň aktivuje jiné signální dráhy, které apoptóze brání. Patologický neuron tedy dostává dva protichůdné signály: jeden mu říká, že je poškozený a má se odstranit, druhý mu v tom zabrání a udržuje ho při životě.
A právě v tom vidíme jeho Achillovu patu. Pokud dokážeme zablokovat dráhy, které patologické buňce brání v apoptóze, umožníme jí dokončit proces, ke kterému už sama směřuje, svou řízenou smrt, a tím ji odstraníme. Zdravé neurony tyto signály zapnuté nemají, takže cílem je zasáhnout selektivně právě patologické buňky a zdravé zachovat.
Jste původně fyzik. Jak jste se dostal k neuronům?
Původně jsem se rozhodoval mezi medicínou a fyzikou, a nakonec jsem šel studovat fyziku. Moje žena začala o rok později studovat medicínu, už jsme spolu bydleli, takže jsem se s ní učil a slyšel anatomii, biofyziku a další předměty a hrozně mě to fascinovalo. Postupně jsem se proto i ve fyzice začal stáčet k biofyzice. Bakalářskou práci jsem dělal na nukleární magnetické rezonanci, na dva roky jsem si přidal paralelní studium biologie na PřF UK, v magisterském studiu už jsem se zabýval proteiny, buňkami a optikou.
Pak se objevila zajímavá příležitost v Ústavu experimentální medicíny v laboratoři profesora Syky. Pořídili tehdy úplnou novinku – dvoufotonový intravitální mikroskop, první svého druhu v České republice. Měli přístroj, ale neměli člověka, který by s ním uměl pracovat. Já to také neuměl, takže jsem se to musel naučit.
První dva roky byly ve znamení brutální frustrace. Učil jsem se pracovat s mikroskopem, operovat myši a občas vyjel do zahraničí získat zkušenosti. Nebyl ani software, kterým bychom mohli data zpracovávat, takže jsme ho s jedním kolegou napsali sami. Trvalo asi pět let, než z toho začaly vznikat první publikace. A mezitím už se ze mě stal neurovědec.
Po doktorátu v neurovědách a pobytu v USA mi profesor Komárek (dětský neurolog a emeritní děkan 2. LF UK – pozn. red.) nabídl možnost vybudovat na 2. lékařské fakultě malou laboratoř zaměřenou na preklinické neurovědy. Začínali jsme ve dvou prázdných místnostech a postupně se pracoviště rozrostlo až do dnešní podoby.
Dává vám fyzikální vzdělání něco, na čem můžete v neurovědách dodnes stavět?
Určitě. Matfyz člověka naučí specifickým způsobem myslet. V matematice se učíte: věta, důkaz, věta, důkaz. Co nedokážete, neplatí. Díváte se na problém jako na celek, který postupně rozeberete na součástky, ty postupně řešíte a skládáte dohromady.
Nechci být neskromný, ale myslím, že právě tohle mi Matfyz určitě dal. Ty roky frustrace nad jedním matematickým příkladem za druhým mě vlastně vytrénovaly i pro vědu, kterou dělám dnes. Když přede mnou stojí nějaký problém, mám schopnost ho rozebrat a vyřešit.
Co vás na fungování mozku nejvíc fascinuje?
Mozek mě fascinuje jako asi nejsložitější systém, který ve vesmíru existuje. Je v něm schované naše „já“. Postupně jsem se ale dostal k tomu, že nechci pouze odhalovat základní principy toho, jak věci fungují. Potřebuji za tím vidět i odpověď na otázku: a čemu to pomůže? Dnes už to mám nastavené tak, že mým cílem není mít dvacet nejlepších publikací. Pokud se nám podaří skutečně pomoci dvěma nebo třem dětem, budu si moct říct, že mám v životě splněno.
| Mgr. Ondřej Novák, Ph.D. |
| Fyzik a neurovědec, vedoucí Laboratoře optofyziologie neuronálních okruhů Ústavu fyziologie 2. LF UK. Vystudoval fyziku na MFF UK, doktorát získal v neurovědách. Zaměřuje se především na mechanismy vzniku epileptických záchvatů a možnosti kauzální léčby epilepsie spojené s vývojovými malformacemi mozku. Využívá přitom pokročilé metody intravitální optické mikroskopie, které umožňují sledovat aktivitu jednotlivých neuronů v živém mozku. |
